WIWAM高通量植物表型成像系統—擬南芥和玉米轉基因品系的功能分析

保守的聚（ADP-核糖基）化(PAR)途徑由三個遺傳成分組成，它們是調節植物在脅迫下的能量穩態的潛在目標，目的是提高作物的產量穩定性并幫助確保糧食供應。我們通過在擬南芥和玉米 (Zea mays) 中使用轉基因方法研究了PAR途徑組分ADP-核糖/NADH 焦磷酸水解酶 (AtNUDX7) 在產量和輕度干旱脅迫中的作用。擬南芥AtNUDX7 cDNA分別通過花椰菜花葉病毒35S啟動子和強啟動子Brachypodium distachyon pBdEF1a在擬南芥和玉米中過表達。AtNUDX7在擬南芥中的過度表達改善了通過一種新的自動化方法測量的種子參數，加速了開花并降低了花序高度。這種有益特性的組合表明，擬南芥中的 AtNUDX7 過表達可能會通過在聚（ADP-核糖基）化能量穩態途徑中提供 ATP 源來增強 ADP-核糖再循環步驟并維持能量水平。在自動化平臺上分析了 AtNUDX7 基因高、中和低過表達水平的擬南芥和玉米品系，并在輕度干旱脅迫條件下確定了幾個生長參數的抑制作用。數據顯示，擬南芥AtNUDX7基因在擬南芥和玉米中不同水平的組成性過表達并沒有提高對輕度干旱脅迫的耐受性，但下調AtNUDX7的表達確實提高了耐性，但在正常條件下以犧牲一般生長為代價。

AtNUDX7 基因 (AT4G12720) 的全長 cDNA 在組成型花椰菜花葉病毒35S啟動子控制下使用植物網關表達載體pK2GW7在擬南芥哥倫比亞 (Col-0) 種質中過表達，其攜帶新霉素磷酸轉移酶 II (nptII) 選擇標記基因（圖1A）。花浸轉化后，在含卡那霉素的培養基上以高密度平板選擇 T0 轉基因擬南芥植物，隨后鑒定出具有單基因座純合 T-DNA 插入的 T3 品系。p35S::AtNUDX7 系和 Col-0 對照植物的兩周大T3幼苗用于定量 (q) PCR 表達分析。與 Col-0 對照相比，在 10 個獨立的轉基因 p35S::AtNUDX7 系中觀察到 AtNUDX7 的高、中和低過表達水平，范圍在 2 倍到 50 倍之間（圖1B）。我們將其命名為 Atnudx7-1 (SALK-046441) 的功能喪失突變株系，在 Col-0 背景中在 AtNUDX7 基因的外顯子 1 中插入了 T-DNA，驗證了其 T-DNA 插入位置，純合 T-DNA 插入，AtNUDX7 基因表達，并用作陰性對照（圖 1C）。：種子產量；開花時間；水分虧缺；輕度干旱脅迫；組成型啟動子。

圖1.AtNUDX7在擬南芥和玉米中的過表達

研究了兩個高過表達(OE) 系 AtNUDX7_OE-At1 和 AtNUDX7_OE-At2、中等OE系AtNUDX7_OE-At3、低OE系AtNUDX7_OE-At5、Atnudx7-1 突變系（Salk -046441_1) 和 Col-0 控制線。呈現并總結了為p35S::AtNUDX7 OE 系、Atnudx7-1 突變系和 Col-0 對照系確定的種子產量和產量相關參數（圖2,3）。與 Col-0 相比，高OE品系AtNUDX7_OEAt2 每株植物的總種子重量顯著增加，每 10 個長角果的種子數（種子數）顯著增加，種子質量和大小與 Col-0 相當。在中等 OE 品系 AtNUDX7_OE-At3 中可以看到種子數量、種子大小和每粒種子質量的顯著增加，但在總種子重量中沒有。通過稱重*成熟和干燥時收獲的總種子來確定總種子重量，而成像用于確定種子數量和種子大小。如(材料和方法)所述計算每粒種子的質量。盡管 AtNUDX7_OE-At3 中的種子數量、種子大小和每粒種子的質量有所增加，但獲取種子參數的方法的差異可能是總種子重量沒有增加的原因。在低 OE 系 AtNUDX7_OE-At5 中，每株植物的總種子重量也顯著增加，而種子數、種子大小和每粒種子質量保持不變（圖2和3）。在重復實驗中，在相同的三個AtNUDX7 OE_At2、AtNUDX7 OE_At3 和 AtNUDX7 OE_At5 品系中測量了改進的種子產量參數，但在高和中OE品系中比在低OE品系中更顯著。

圖2.T3 p35S::AtNUDX7 擬南芥過表達系、Atnudx7-1突變系(SALK-046441_1) 和Col-0系的種子產量和開花時間參數

圖3. 四個T3 p35S:AtNUDX7過表達系和AtNUDX7-1突變系種子產量和開花時間參數的熱圖

圖4.在輕度干旱脅迫實驗中測量的終點參數，以比較純合pBdEF1a::AtNUDX7 過表達 T3 玉米品系、AtNUDX7_OE-Zm1、AtNUDX7_OE-Zm2 和 AtNUDX7_OEZm3 與 B104 對照玉米在充足澆水和缺水條件下

每天測量第4片葉子的長度，從植物的基部到葉尖，從外觀到成熟，并用于確定葉子的生長速率。當第4片葉片停止生長時，測量其葉片重量、葉片和葉鞘重量、葉片寬度、總葉面積以及幼苗的鮮重和干重。分析了三個T3純合玉米系AtNUDX7_OE-Zm1、AtNUDX7_OE-Zm2和AtNUDX7_OE-Zm3，分別具有AtNUDX7基因的高、中、低過表達水平，以及B104對照系。水分虧缺時，高表達和低表達玉米系AtNUDX7_OE-Zm1和AtNUDX7_OE-Zm3在所有測量參數中的減少百分比均高于B104野生型，盡管沒有統計學意義。然而，在水分虧缺條件下中等過表達系AtNUDX7_OE-Zm2的葉片4葉片重量、葉片和葉鞘重量、葉片寬度和總葉面積比B104對照組分別減少15%、16%、9%和15%（圖4），而AtNUDX7_OE-Zm2品系在水分虧缺條件下的植物生物量和植物干重減少與B104玉米對照沒有統計學差異（圖4）。此外，水分虧缺處理后，三個AtNUDX7過表達玉米系的葉4生長減少百分比與B104對照沒有顯著差異。在自動化平臺上進行了三次重復的缺水試驗；在前兩個實驗中，每個基因型的個體較少，大多數參數與B104玉米對照沒有顯著差異。