WIWAM高通量植物表型成像分析平臺病蟲害研究

隨著人們生態(tài)意識的提高，科學(xué)家們一直在探索減少使用化學(xué)殺蟲劑來控制病蟲害的新策略。觸發(fā)植物內(nèi)在防御系統(tǒng)是減少線蟲等病原生物產(chǎn)量損失的有效策略之一。抗壞血酸氧化酶（AO）通過抗壞血酸氧化過程調(diào)節(jié)質(zhì)外體抗壞血酸/脫氫抗壞血酸（DHA）的比例，在植物防御中發(fā)揮重要作用。抗壞血酸氧化可誘導(dǎo)水稻對寄生根結(jié)線蟲（RKN）的系統(tǒng)抗性。在這里，我們試圖評估AO或DHA是否誘導(dǎo)對RKNM的耐藥性（IR）。graminicola涉及苯丙烷途徑的激活，以及該IR表型是否對脅迫和非脅迫條件下水稻幼苗的生長具有潛在影響。我們的結(jié)果表明，AO/DHA-IR對抗這些寄生線蟲依賴于苯丙氨酸解氨酶（PAL）的激活。然而，應(yīng)用還原抗壞血酸（AA）并沒有引起這種反應(yīng)。通過qRT PCR進(jìn)行的基因表達(dá)分析表明，OsPAL2和OsPAL4在噴灑AO/DHA的線蟲感染根中高度表達(dá)，PAL活性測定證實，噴灑AO/DHA可觸發(fā)植物在線蟲感染時激活該酶。AO/DHA-IR對噴灑化學(xué)PAL抑制劑的植物無效，證實AO/DHA誘導(dǎo)的抗性取決于PAL活性。在AO/DHA噴施的植物中，植物生長的改善和線蟲感染的降低被發(fā)現(xiàn)與芽葉綠素?zé)晒猓‵v/Fm）、葉綠素指數(shù)（ChlIdx）和改良花青素反射指數(shù)的增加相關(guān)，這被證明是線蟲侵染的良好地上參數(shù)。詳細(xì)的生長分析證實，在線蟲感染的條件下，AO/DHA處理的植物生長得到改善。綜上所述，我們的結(jié)果表明，抗壞血酸氧化增強(qiáng)了基于苯丙烷的線蟲感染反應(yīng)，并導(dǎo)致處理后的水稻植株表現(xiàn)出耐性表型。

本文中葉面AA、AO或DHA處理對水稻植株的影響通過計算蟲癭的數(shù)量得到獨(dú)立證實，并通過計算產(chǎn)卵雌性（ELF）的總數(shù)得到擴(kuò)展。與模擬噴灑植物進(jìn)行比較，在水稻植株上葉面施用AO和DHA可顯著減少接種后14天記錄的蟲癭數(shù)量（圖1A），噴灑AO和DHA也減少了ELF的數(shù)量（分別減少87%和80%；圖1B）。噴灑AA不會引起蟲癭（圖1A）或ELF（圖1B）數(shù)量的任何顯著變化。

為了研究噴灑 AO 和 DHA 的水稻植株的低禾本科植物易感性是否是由于苯丙烷途徑的改變，對 14 天大的水稻植株噴灑了 AO 或 DHA 或模擬噴灑。量化了 OsPAL2 和 OsPAL4 的表達(dá)，并在接種后3天（即噴灑后 4 天）測量了 PAL 活性。對感染和未感染植物的枝條以及未感染植物的癭與根尖進(jìn)行分析。qRT-PCR分析表明，與未感染的未處理植物相比，OsPAL2 和 OsPAL4 在DHA 噴灑未感染植物的枝條中均顯著下調(diào)（圖 1C）。然而，在根組織中，OsPAL4 基因的表達(dá)在 DHA 噴灑后被顯著誘導(dǎo)（圖 1D）。在線蟲誘導(dǎo)的癭中，與模擬噴灑的未感染或感染植物相比，在 AO 和 DHA 噴灑植物中觀察到 OsPAL2 和 OsPAL4 基因的表達(dá)水平顯著更高（圖 1D）。PAL 活性測量證實了其酶促活化。數(shù)據(jù)顯示，與模擬噴灑植物相比，噴灑 AO/DHA 植物的枝條中的 PAL 活性顯著增加（~32%），而與感染無關(guān)（圖 1E）。此外，在 AO/DHA 噴灑植物的癭中，與 AO/DHA 噴灑植物的未感染根尖相比，觀察到 PAL 活性顯著增加（圖 1F），表明 AO/DHA 噴灑觸發(fā)植物進(jìn)行 PAL線蟲感染后蟲癭中的活性。

為了證實 PAL 活性參與 AO/DHA 誘導(dǎo)的抗性，使用化學(xué) PAL 抑制劑 AOPP 的葉面施用進(jìn)行了獨(dú)立的感染實驗。當(dāng)化學(xué)阻斷這種酶時，未觀察到癭體數(shù)量（圖 1G）或 ELF 數(shù)量（圖 1H）的顯著差異，證實了之前的觀察結(jié)果。數(shù)據(jù)再次顯示，與模擬噴灑 (Ctrl) 植物相比，噴灑 AO/DHA 的植物中的癭（圖 1G）和 ELF（圖 1H）數(shù)量顯著減少（減少 50-70%）。然而，用 AO 或 DHA 與 AOPP 組合噴灑的植物表現(xiàn)出增強(qiáng)的禾本科小球藻易感性，達(dá)到在模擬噴灑 (Ctrl) 植物中觀察到的嚴(yán)重程度，表明 AO/DHA 誘導(dǎo)的抗性取決于 PAL 活性。

圖1.葉面噴灑AO和DHA通過激活PAL誘導(dǎo)水稻根系對禾本科禾本科的系統(tǒng)抗性

與未感染的植物相比，在所有處理中，線蟲感染植物的枝條中通常觀察到顯著更高的mARI 值，（圖2A）。數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示，與所有其他處理相比，線蟲攻擊后 DHA 噴灑植物的 mARI 值顯著增加（圖 2A）。觀察 Fv/Fm，與未感染植物的枝條相比，線蟲感染植物枝條的值顯著降低，但僅當(dāng)植物被模擬噴灑或噴灑 AA 時（圖 2B）。相反，與模擬噴霧或 AA 噴霧植物的枝條相比，AO 或 DHA 噴霧感染植物枝條的 Fv/Fm 值顯著增加（圖2B）。確認(rèn)降低的 Fv/Fm，數(shù)據(jù)還顯示與未感染植物相比，模擬噴霧感染植物的枝條中 ChlIdx 的值顯著降低（圖 2C）。

圖2.AO/DHA噴施植物生長的改善和線蟲感染的減少與莖Fv mARI、Fv/Fm和ChlIdx的增加有關(guān)

在噴灑前（14 天）測量植物，然后在 18、22 和 26 天時使用（Mg+）或不使用（Mg-）再次測量以監(jiān)測它們的生長。在第18天和第26天（圖3A），未處理的感染 (Mg+) 植物與 Ctrl (Mg-) 相比，在未處理的感染 (Mg+) 植物中觀察到枝條高度略有下降（30%，不顯著），這說明線蟲感染對地上水稻生長。然而，當(dāng)植物預(yù)先噴灑 AO 或 DHA 時，這種效果就被抵消了。在 26 天時，與未處理的感染植物 (Mg+) 相比，在 AO 或 DHA 噴灑的植物中，在線蟲感染 (Mg+) 下，芽高度顯著增加（圖 3A）。早在噴灑后 4 天就觀察到 AO/DHA 對枝條高度的積極影響，但線蟲感染的植物 (Mg+) 比未接種的 (Mg-) 植物強(qiáng)得多。與未處理或噴灑 AA 的植物相比，AO/DHA 處理的植物在 22 天和 26 天時根長顯著增加，這種效果似乎主要是在線蟲感染條件下放大了（圖3B）。

圖3.AO/DHA可促進(jìn)根系生長并誘導(dǎo)對線蟲脅迫的耐受性